核心提示： 微生物長期受到外界的影響，遺傳性狀必然發(fā)生某些變異。正是由于變異的存在才使得生物向前進化。然而由于突變的存在，菌種
微生物長期受到外界的影響，遺傳性狀必然發(fā)生某些變異。正是由于變異的存在才使得生物向前進化。然而由于突變的存在，菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，可能會出現(xiàn)某些優(yōu)良生產性狀的劣化、遺傳標記丟失、典型特征改變等現(xiàn)象，稱為菌種衰退。比如蘇云金芽孢桿菌由于菌種衰退，導致其新生的菌體芽孢和伴孢晶體都比較??；保藏的沙門氏菌鞭毛抗原丟失，導致H多價血清不凝固等。
01
菌種衰退原因
菌種衰退的根本原因是有關基因的負突變。如果控制產量的基因發(fā)生負突變，則表現(xiàn)為產量下降；如果控制孢子生成的基因發(fā)生負突變，則產生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過程中會發(fā)生自發(fā)突變。雖然自發(fā)突變的幾率很低(一般為10-6~10-9)，尤其是對于某一特定基因來說，突變頻率更低。但是由于微生物具有的代謝繁殖能力，隨著傳代次數(shù)增加，衰退細胞的數(shù)目就會不斷增加，在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢，最終成為一株衰退了的菌株。此外，菌種衰退還有以下幾種原因：
1、表型延遲造成菌種衰退
表型延遲現(xiàn)象也會造成菌種衰退。如，在誘變育種過程中，經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)某菌株初篩時產量較高，進行復篩時產量卻下降了。
2、質粒脫落導致菌種衰退
質粒脫落導致菌種衰退的情況在抗生素生產中較多，不少抗生素的合成是受質?？刂频摹．斁昙毎捎谧园l(fā)突變或外界條件影響(如高溫)，致使控制產量的質粒脫落或者核內DNA和質粒復制不一致，即DNA復制速度超過質粒，經(jīng)多次傳代后，某些細胞中就不具有對產量起決定作用的質粒，這類細胞數(shù)量不斷提高達到優(yōu)勢，則菌種表現(xiàn)為衰退。
3、連續(xù)傳代
連續(xù)傳代是加速菌種衰退的一個重要原因。一方面，傳代次數(shù)越多，發(fā)生自發(fā)突變(尤其是負突變)的幾率越高；另一方面，傳代次數(shù)越多，群體中個別的衰退型細胞數(shù)量增加并占據(jù)優(yōu)勢越快，致使群體表型出現(xiàn)衰退。
4、不適宜的培養(yǎng)和保藏條件
不適宜的培養(yǎng)和保藏條件是加速菌種衰退的另一個重要原因。不良的培養(yǎng)條件如營養(yǎng)成分、溫度、濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等，不僅會誘發(fā)衰退型細胞的出現(xiàn)，還會促進衰退細胞迅速繁殖，在數(shù)量上大大超過正常細胞，造成菌種衰退。
02防止菌種衰退措施
采用已衰退菌種進行生產會影響生產效率，而把已衰退菌種作為陽性菌株進行檢驗，則會影響檢驗正確率。既然變異是不可避免的，那么我們應該如果避免菌種衰退呢？
1、控制傳代次數(shù)
盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代減少到的水平以減少突變幾率。傳代次數(shù)越多，產生突變的幾率就越大，菌種發(fā)生衰退的機會就越高。在實驗室檢驗或者是生產實際中，應嚴格控制傳代次數(shù)。中國藥典當中規(guī)定，培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代，以防止菌株因傳代次數(shù)過多引起衰退影響檢驗。
2、利用不同類型細胞進行接種傳代
放線菌，霉菌用菌絲進行移種比分生孢子容易衰退，因菌絲是對核且有異核存在，所以移種霉菌適宜采用孢子。
3、良好的培養(yǎng)條件
不良的培養(yǎng)條件會衰退細胞的出現(xiàn)，因此采用適宜的培養(yǎng)基進行菌種培養(yǎng)，以減少衰退幾率
4、采用有效的菌種保藏方法
根據(jù)保存時間的長短，選擇適宜的保存方法。
傳代培養(yǎng)法：復蘇后的第一代放于4℃冰箱或室溫保存，定期傳代培養(yǎng)。保藏時間依微生物種類而定。如，芽孢、霉菌、酵母菌保存6個月轉一次，普通細菌1個月轉一次，假單胞菌2周轉一次
甘油凍存法：將復活后經(jīng)過性能確認的菌株新鮮培養(yǎng)物(一般是第二代菌株)，用0.85%的滅菌生理鹽水(約1-2ml)洗斜面菌苔成菌懸液；將上述菌懸液吸取適量于滅菌管(凍存管)中(如，滅菌管容量為5ml，則取1.5ml菌液)，加入等體積的40%滅菌甘油，混勻，密封。保藏溫度為—20℃，一般可保存1-2年。
瓷珠保存管保存：菌株保藏管內含特制的小珠(20-25顆)和特殊溶液，只需將培養(yǎng)好的菌株接入溶液中，搖勻成菌懸液，細胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，將保藏管置-70℃可保存5年，置-20℃可保存2-3年。
小貼士
瓷珠保存管保存具體操作：
第一步：對需要保存的菌株進行必要的純化，挑取生長旺盛時期的菌落，接入菌株
保藏管中，通常需要接入4-7環(huán)，對于苛養(yǎng)菌應多接一些；
第二步：擰上蓋子，充分劇烈震蕩；
第三步：用無菌吸管將溶液吸走，盡可能吸干；
第四步：馬上放入冰箱中，溫度越低越有利于保存(推薦使用-70℃超低溫冰箱)；
第五步：復蘇時，只需將小珠在平板上滾動或置肉湯中培養(yǎng)。
